| Revista: | Investigación clínica |
| Base de datos: | PERIÓDICA |
| Número de sistema: | 000402411 |
| ISSN: | 0535-5133 |
| Autores: | Rengifo González, Juan1 Medina Mora, Yollyseth1 Silva Barrios, Sasha1 Márquez Contreras, María Elizabeth1 Tibisay Ruiz, María1 Cáceres, Ana J1 Concepción, Juan Luis1 Quiñones, Wilfredo1 |
| Instituciones: | 1Universidad de Los Andes, Facultad de Ciencias, Mérida. Venezuela |
| Año: | 2016 |
| Periodo: | Jun |
| Volumen: | 57 |
| Número: | 2 |
| Paginación: | 158-175 |
| País: | Venezuela |
| Idioma: | Inglés |
| Tipo de documento: | Artículo |
| Enfoque: | Aplicado, analítico |
| Resumen en español | Se diseñó y caracterizó un sistema reportero para ser capturado por anticuerpos enlazados a placas de ELISA. El sistema fue diseñado con una proteína altamente antigénica y específica, la rK346 de Leishmania infantum. La rK346 fue acoplada a la peroxidasa C de rábano picante (HRPc) de Armoracia rusticana usando glutaraldehido o sulfo-SMCC. La conjugación con glutaraldehido fue realizada en dos pasos. La separación de los conjugados fue llevada a cabo a través de una cromatografía de exclusión molecular sefarosa S-200 (CES), las fracciones fueron analizadas midiendo la actividad HRPc y por placas ELISA sensibilizadas con inmunoglobulina G policlonal anti-rK346, purificada desde suero de conejo. Se obtuvo una población heterogénea de conjugados rK346-HRPc en un rango de pesos moleculares entre 109,7 ± 16,5 a 67,6 ± 10,1 kDa; con estequiometria rK346-HRPc de 1:2; 2:1; 3:1; y 2:2. La conjugación usando sulfo-SMCC se llevó a cabo primero introduciendo grupos -SH en la HRPc usando el reactivo SATA; el antígeno se modificó con sulfo-SMCC. La separación y el análisis de los conjugados se realizaron de forma similar que con el glutaraldehido, resultando en una población heterogénea de conjugados rK346-HRPc con un rango de pesos moleculares entre 150,5 ± 22,6 a 80,0 ± 12,0 kDa; con estequiometria rK346-HRPC de 2:1; 1:2; 2:2 y 1:3, y con una eficiencia de conjugación incrementada en comparación con glutaraldehido. De esta forma, se habilitó al sulfo-SMCC como un reactivo potencial para acoplar antígenos a la HRPc, como método para el diseño de un sistema reportero económico, especifico y fácil de aplicar, útil en la evaluación de individuos en riesgo y/o en estados tempranos o avanzados de leishmaniasis visceral |
| Resumen en inglés | It was designed and characterized a reporter system to be captured by an- tibodies bound to ELISA plates. The system was designed with the rK346 from Leishmania infantum, a highly antigenic and specific protein. The rK346 was coupled to the horseradish peroxidase C (HRPc) from Armoracia rusticana using glutaraldehyde or sulfo-SMCC. Gluta- raldehyde conjugation was performed in two steps. Separation of conjugates was carried out using a Sepharose S-200 in size exclusion chromatography (SEC); fractions were analyzed via HRPc activity and through ELISA plates sensitized with polyclonal anti-rK346 IgG puri- fied from rabbit serum. A heterogeneous population of conjugates rK346-HRPc was obtained with molecular weights ranging between 109.7 ± 16.5 to 67.6 ± 10.1 kDa; with rK346-HRPc stoichiometries of 1:2; 2:1; 3:1; and 2:2. Conjugation using sulfo-SMCC was carried out first by introducing -SH groups onto the HRPc using the SATA reagent and the antigen was modi- fied with sulfo-SMCC during 45 min. Separation and analysis of conjugates was performed similarly as with glutaraldehyde, resulting in a heterogeneous population of conjugates rK346- HRPc with molecular weights between 150.5 ± 22.6 to 80.0 ± 12.0 kDa; with rK346-HRPC stoichiometries of 2:1; 1:2; 2:2; and 1:3, with an increased conjugation efficiency in compari- son with glutaraldehyde. This enables sulfo-SMCC to be used as a potential reagent for cou- pling the antigen to the HRPc, to design an economic, specific and easy method to apply as a reporter system, available to assess individuals at risk and/or at early and late stages of visceral leishmaniasis |
| Disciplinas: | Medicina |
| Palabras clave: | Diagnóstico, Microbiología, Leishmaniasis, Conjugación, Proteínas, Sistema reportero, Antígenos, Leishmania infantum |
| Keyword: | Medicine, Diagnosis, Microbiology, Leishmaniasis, Conjugation, Proteins, Reporter system, Antigens, Leishmania infantum |
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