| Journal: | Bioquimia |
| Database: | PERIÓDICA |
| System number: | 000331035 |
| ISSN: | 0185-5751 |
| Authors: | Miranda Miranda, Estefan1 Murillo Sánchez, María Hortensia1 Cossío Bayúgar, Raquel1 |
| Institutions: | 1Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias, Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, Jiutepec, Morelos. México |
| Year: | 2007 |
| Season: | Jul-Sep |
| Volumen: | 32 |
| Number: | 3 |
| Pages: | 83-90 |
| Country: | México |
| Language: | Español |
| Document type: | Artículo |
| Approach: | Experimental, aplicado |
| Spanish abstract | Reportamos en este trabajo la clonación y expresión en el sistema de Baculovirus, de una cisteín proteasa (CP), del nematodo parásito gastroentérico de rumiantes Haemonchus contortus, con el objetivo de obtener con fines inmunodiagnósticos una proteasa recombinante con propiedades bioquímicas e inmunogénicas semejantes a las naturales aplicable a las campañas de diagnóstico, prevención y control de la hemoncosis ovina. Se aisló el gene correspondiente a la CP por medio de PCR, partiendo de cADN de H. contortus, la secuencia de ADN se clonó en fase con el promotor de polihedrina en un vector de expresión replicable en bacterias, se usaron células de lepidóptero Sf9 co-transfectadas simultáneamente con el CP-vector y ADN desnudo de baculovirus, las cuales originaron por recombinación homóloga, virus recombinantes con capacidad de expresar la CP en cultivos de células de insecto. La CP se identificó como un precursor inactivo fusionado con un sitio de afinidad 6XHis y se aisló por cromatografía de afinidad para generar CP activa enzimáticamente. La proteasa recombinante fue identificada por el suero de ovinos experimentalmente infestados con H. contortus tanto por inmunoelectrotransferencia como por ELISA, así como por su efecto catalítico sobre proteínas copolimerizadas en SDS-PAGE, el sistema de expresión en baculovirus mostró un rendimiento de 400 mg de antígeno diagnóstico recombinante por cada litro de medio (400 mg L-1). Se concluye que la CP recombinante obtenida es semejante a la natural proveniente del parásito, se produce in vitro en grandes cantidades y puede ser aplicada en ensayos inmunodiagnósticos e inmunoprofilácticos destinados al inmunodiagnóstico y control de la hemoncosis de rumiantes |
| English abstract | We report a molecular cloning and expression in the baculovirus system of an Haemonchus contortus recombinant cystein protease (CP) gene, with the objective of obtaining a recombinant CP with biochemical and immunochemical properties similar to the natural one obtained from the parasite, with applications to the diagnosis prevention and control of sheep hemonchosis. The CP gene was isolated by PCR from H. contortus cDNA, the gene was cloned downstream to the polihedrin promoter within a bacterial expression vector, Sf9 insect cells were used co-transfected simultaneously with the CP-vector and baculovirus naked DNA which originated recombinant viruses by homologous recombination capable to express recombinant CP in vitro in an insect cell culture. A recombinant protease was identified as an inactive fusion protein with an affinity 6XHis moiety, it was purified by affinity chromatography in order to obtain enzymatically active recombinant protease which was identified by H. contortus experimentally infested ovine sera assayed by western blot and ELISA as well as by enzyme activity on PAGE-gelatin, the baculovirus expression system yielded 400 mg of recombinant diagnostic antigen per liter of culture media (400 mg L-1). We concluded that the obtained recombinant CP is similar to the natural one obtained from the parasite, can be obtained in large amounts from the transfected insect cell culture an may be applied in the immunodiagnostics and control of ruminant haemonchosis |
| Disciplines: | Química, Medicina veterinaria y zootecnia |
| Keyword: | Parasitología, Inmunología, Baculovirus, Hemoncosis, Cisteína proteasa, Antígenos recombinantes, Rumiantes |
| Keyword: | Chemistry, Veterinary medicine and animal husbandry, Parasitology, Immunology, Baculovirus, Hemonchosis, Cysteine protease, Recombinant antigens, Ruminants |
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