Solubilization and partial characterization of ouabain-insensitive Na+-ATPase from basolateral plasma membranes of the intestinal epithelial cells



Título del documento: Solubilization and partial characterization of ouabain-insensitive Na+-ATPase from basolateral plasma membranes of the intestinal epithelial cells
Revue: Investigación clínica
Base de datos: PERIÓDICA
Número de sistema: 000324057
ISSN: 0535-5133
Autores: 1
Instituciones: 1Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Centro de Investigaciones Biomédicas, Caracas, Distrito Federal. Venezuela
Año:
Periodo: Sep
Volumen: 50
Número: 3
Paginación: 303-314
País: Venezuela
Idioma: Inglés
Tipo de documento: Artículo
Enfoque: Experimental, aplicado
Resumen en español Ha sido propuesto que el transporte intestinal del sodio es mediado por dos mecanismos: la ATPasa de Na+/K+, inhibida por ouabaina y la ATPasa de Na+ la cual es insensible a la ouabaina y es inhibida por la furosemida. Con la finalidad de determinar las condiciones óptimas para solubilizar la ATPasa de Na+ del enterocito, membranas plasmáticas laterobasales fueron solubilizadas utilizando diferentes detergentes, octyl glucoside, Tween 20, C12E8 y C12E9. La solubilización de la ATPasa de Na+ y de la ATPasa de Na+/K+ fue óptima después de mezclar 1 mg de membranas con 1,5 mg de C12E9. El C12E9 solubilizó más del 60% de las proteinas de membranas y las ATPasas de Na+ y Na+/K+ fueron recuperadas en un 80% en la fracción soluble. Adicionalmente, cuando glicerol al 25 % y ATP 2 mM fueron utilizados, la ATPasa de Na+ fue estable despues de 3 dias. La ATPasa de Na+ soluble demostró las siguientes características cinéticas: 1) es específicamente estimulada por sales de Na+; 2) K0.5 para Na+= 4.62 ± 0.1 mM; 3) es estimulada por todas las sales de Na+, 4) pH óptimo= 7.0; 5) es inhibida por furosemida (IC50= 0,52 ± 0,10 nm). Las características cinéticas de la enzima solubilizada fueron similares a las descritas para la forma de la enzima unida a la membrana. Este trabajo demuestra la solubilización y caracterización de la ATPasa Na+ a partir de membranas laterobasales del enterocito usando C12E9
Resumen en inglés It has been proposed that intestinal sodium transport is mediated by two different active mechanisms: the ouabain-sensitive Na+/K+-ATPase and ouabain-insensitive Na+-ATPase. In order to determine the optimum conditions to solubilize the membrane-bound Na+-ATPase of enterocyte, basolateral plasma membranes were solubilized using different amounts of octyl glucoside (O.G), Tween 20, octaethylene glycol monododecyl ether (C12E8), and polyoxyethylene 9-lauryl ether (C12E9). Solubilized fractions were assayed for protein concentration and ATPase activity and characterized by electrophoresis analysis. Optimal solubilization of Na+-ATPase was obtained after mixing of 1 mg of basolateral plasma membrane with 1.5 mg of C12E9. Under these conditions, C12E9 solubilized over 60% membrane protein and Na+- and Na+/K+- ATPases activities were recovered over 80% in the soluble fraction without inactivation. In addition, when 25 % glycerol and 2 mM ATP were added, the solubilized Na+-ATPase was stable after 3 days at 4°C. The C12E9-solubilized Na+-ATPase presented the following kinetic characteristics: 1) is only stimulated by the Na+ salt, 2) K0.5 for Na+= 4.62 ± 0.06 mM, 3) is similarly stimulated by the Na+ salt of different anions, 4) optimal pH= 7.0, 5) inhibited by furosemide (IC50= 0.52 ± 0.10 nm). These kinetic properties of the solubilized Na+-ATPase were similar to those described to the native membrane-bound enzyme. This work reports for the first time, solubilization and characterization of a fully active and stable Na+-ATPase from basolateral plasma membranes of enterocyte using C12E9
Disciplinas: Biología,
Química
Palabras clave: Biología celular,
Bioquímica,
Intestino delgado,
Células epiteliales,
Bomba de sodio,
ATPasa,
Furosemida
Keyword: Biology,
Chemistry,
Cell biology,
Biochemistry,
Small intestine,
Epithelial cells,
Sodium pump,
ATPase,
Furosemide
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