Optimización de un método de preparación de ADN a partir de muestras de esputo para la detección por la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de Mycobacterium tuberculosis
Título del documento: Optimización de un método de preparación de ADN a partir de muestras de esputo para la detección por la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de Mycobacterium tuberculosis
Revista: Ciencia (Maracaibo)
Base de datos: PERIÓDICA
Número de sistema: 000367658
ISSN: 1315-2076
Autors: 1
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2
1
Institucions: 1Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Mérida. Venezuela
2Instituto de Biomedicina, Laboratorio de Tuberculosis, Caracas, Distrito Federal. Venezuela
Any:
Període: Ene-Mar
Volum: 14
Número: 1
Paginació: 46-55
País: Venezuela
Idioma: Español
Tipo de documento: Artículo
Enfoque: Caso clínico, analítico
Resumen en español En este estudio optimizamos un procedimiento casero para la preparación y extracción del ADN de micobacterias en esputos para el diagnóstico por la RCP de la tuberculosis pulmonar. Inicialmente se utilizaron 14 esputos (BK+++) para evaluar la actividad fluidificante de 5 sustancias: N-acetil-L-cisteína (NALC) 30mM-Hidróxido de sodio (NaOH) al 4%, NALC 30 mM, NaOH al 4%, Cloruro de cetilpiridinium (CPC) del 1% al 3%-Cloruro de sodio (NaCl) al 2% e Hipoclorito de sodio (NaOCl) al 4,5%. Las muestras fluidificadas se sometieron a la acción independiente de la lisozima o el tritón X-100 conjuntamente con estrés térmico. La extracción del ADN se confirmó mediante la detección de la secuencia de inserción IS6110 de M. tuberculosis por la RCP. De las sustancias fluidificantes probadas, el NaOCl al 4,5% produjo una fluidificación rápida del esputo. El tratamiento posterior de la muestra con lisozima y los cambios térmicos permitieron evidenciar la amplificación de la secuencia IS6110. El valor diagnóstico de esta optimización se evaluó en 30 esputos positivos para M. tuberculosis por baciloscopía y cultivo. Los resultados demostraron que en el 66,67% de las muestras se logró detectar la secuencia IS6110 y en el 33,33% de las muestras restantes con baja carga bacteriana (8, BK++ y 2, BK+), la secuencia IS6110 se detectó luego de diluir el ADN o agregar albúmina sérica bovina acetilada a la mezcla de amplificación. La metodología propuesta tiene una limitada sensibilidad, pero puede aumentarse diluyendo el ADN o adicionando sustancias que reviertan los inhibidores de la RCP. Este es el primer trabajo donde se utiliza el NaOCl al 4,5%, como sustancia fluidificante para la preparación de esputos que serán utilizados en el diagnóstico de tuberculosis pulmonar mediante la RCP
Resumen en inglés In this study we present an in-house method to optimize preparation and DNA extraction of mycobacteria in sputum samples to diagnose pulmonary tuberculosis using PCR. Initially, 14 positive sputum samples (BK +++) were utilized to evaluate the mucolytic capacity of 5 different substances: 30mM N-acetyl cysteine-4% NaOH, sodium hydroxide (NaOH), NALC 30 mM, cetilpiridinium chloride (1%, 2% and 3%)-2% NaCl and 4,5% sodium hypochlorite (NaOCl). Fluidified samples underwent lysozyme or triton X-100 treatment together with heat shock. The DNA extraction was confirmed by means of detection of the IS6110 gene sequence in M. tuberculosis. Of the 5 mucolytic substances tested, 4,5% NaOCl produced a fast fluidification of the sputum. The amplification of IS6110 on samples fluidified with 4,5% NaOCl and treated with lysozyme was observed by PCR assays. The diagnostic value of this method was evaluated on 30 Ziehl Neelsen-positive sputum samples and cultures. Results show that the IS6110 gene sequence was detected in 66.67% of the samples. On the remaining 33.33% of low bacterial load positive sputum samples (8, BK++ and 2, BK+), the IS6110 was detected after diluting the DNA or adding acetylated bovine serum albumin to the PCR mix. Our tests indicate that even when the IS6110 detection has a limited sensitivity, the latter can be greatly increased by means of diluting the DNA or by adding PCR enhancers. This is the first report where the 4,5% NaOCl has been used for preparation of DNA from sputum samples for detection of M. tuberculosis by PCR
Disciplines Medicina,
Química
Paraules clau: Diagnóstico,
Bioquímica,
Bacterias,
Fluidificación,
NaOCl,
IS6110,
Mycobacterium tuberculosis,
RCP
Keyword: Medicine,
Chemistry,
Diagnosis,
Biochemistry,
Bacteria,
Fluidification,
NaOCl,
IS6110,
Mycobacterium tuberculosis,
PCR
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