| Revista: | Biotecnología aplicada |
| Base de datos: | PERIÓDICA |
| Número de sistema: | 000349802 |
| ISSN: | 0864-4551 |
| Autores: | Tejeda, Yelaine1 Fernández, Julio Raúl1 Colarte, Amanda B1 Taylor, Clara Y1 |
| Instituciones: | 1Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, División de Inmunodiagnóstico y Genómica, La Habana. Cuba |
| Año: | 2011 |
| Volumen: | 28 |
| Número: | 3 |
| Paginación: | 164-167 |
| País: | Cuba |
| Idioma: | Inglés |
| Tipo de documento: | Artículo |
| Enfoque: | Experimental, aplicado |
| Resumen en español | Un paso limitante en muchos análisis del proteoma a alto flujo es la clonación de losmarcos abiertos de lectura (ORF) en los vectores específicos para cada técnica. Por ejemplo, las metodologías para la detección de interacciones entre proteínas tales como el ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H) requieren una validación utilizando métodos alternativos, como por ejemplo los ensayos de complementación de fragmentos de la proteína (PCA) o experimentos de precipitación de proteinas. Diversas alternativas experimentales para una rápida transferencia mediante la recombinación homóloga de genes in vivo entre los vectores Y2H y PCA fueron evaluadas. Dos juegos de cebadores universales con una superposición de homología entre 31 b de los insertos y los vectores aceptadores fueron diseñados y las condiciones de amplificación de la reacción de PCR fueron evaluadas. Los productos de PCR fueron cotransformados con el vector aceptor en cepas de E. coli que permiten la clonación mediante recombinación homóloga. El método demostró ser eficaz para la clonación de cinco ORFs con tamaños que oscilan entre 0.294 a 1.2 kb. El método propuesto permite la rápida transferencia de los marcos abiertos de lectura entre los vectores de los sistemas de Y2H y PCA mediante el uso de un conjunto universal de los cebadores. El método de clonaje no depende de la presencia de determinadas sitios de restricción en el vector aceptor y no provoca cambios en el marco abierto de lectura. Este sistema será útil para la validación de rutina de las interacciones de proteínas. Tambien mostramos la viabilidad de la cepa DH10B para la clonación por recombinación homóloga |
| Resumen en inglés | A common rate-limiting step in many high throughput proteome scale analyses is the cloning of predicted open reading frames (ORFs) into technique-specific vectors. For example, methodologies for the detection of protein interactions such as Yeast-two-hybrid (Y2H) assay require validation using alternative methods as Protein Fragment Complementation Assays (PCA) or pulldown experiments. Various experimental alternatives for rapid homologous recombination gene transfer in vivo between the Y2H and PCA vectors were evaluated. Two sets of universal primers sharing an overlap of 31 b homology between inserts and acceptor vectors were designed and PCR performance conditions were tested. Cotransformation of PCR products with the digested acceptor vector in E. coli strain allowed homologous recombination cloning. The method was proved to be effective for cloning 5 ORFs with sizes ranging from 0.294 to 1.2 kb. The proposed method allows the quick transfer of any open reading frames between the Y2H and PCA assay vector systems by using a universal set of primers. It doesn’t depend on the presence of specific restriction sites in the acceptor vector or causes changes in the open reading frame. This system will be useful for routine validation of protein interactions. We also report here the feasibility of DH10B strain for homologous recombination cloning |
| Disciplinas: | Biología |
| Palabras clave: | Bacterias, Genética, Levaduras, Clonación, Híbridos, Recombinación homóloga |
| Keyword: | Biology, Bacteria, Genetics, Yeasts, Cloning, Hybrids, Homologous recombination |
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